Визуализация in vivo одиночных взрослых нервных стволовых клеток в телэнцефалоне данио рерио

Разработчик

Джоана С. Барбоза, Росселла Ди Джиаймо, Магдалена Готц и Йовика Никович

Описание технологии

Взрослые нервные стволовые клетки у данио рерио производят зрелые нейроны на протяжении всей их жизни как в интактном, так и в регенерирующем мозге. Понимание поведения взрослых нервных стволовых клеток в их интактной нише и во время регенерации in vivo должно способствовать выявлению молекулярных механизмов, контролирующих специфические клеточные события регенерации. Более глубокое понимание процесса регенеративно-компетентных видов может позволить достичь регенерации у регенеративно-некомпетентных видов, включая человека.

В рамках данной технологии был разработан протокол для нанесения меток и повторной визуализации взрослых нервных стволовых клеток in vivo. Одиночные взрослые нервные стволовые клетки были помечены, что позволило достичь точной реидентификации одиночных клеток в повторяющихся сеансах визуализации с помощью электропорации репортерной плазмиды с красной флюоресценцией во взрослые нервные стволовые клетки трансгенных рыб Tg (GFAP: GFP) mi2001, экспрессирующих зеленый флюоресцентный белок. Визуализация была достигнута с помощью двухфотонной микроскопии через истонченный череп подвергнутой наркозу и иммобилизованной рыбы. Протокол позволяет проводить визуализацию через каждые 2 дня в течение периода продолжительностью до 1 месяца. Эта методика позволила визуализировать поведение взрослых нервных стволовых клеток in vivo в их природной нише, в отличие от ранее существующих технологий, которые основаны на визуализации либо диссоциированных клеток, либо срезов тканей. Этот протокол был применен для того, чтобы исследовать режим деления взрослых нервных стволовых клеток, изменения их судьбы и клеточную гибель как в интактном, так и в поврежденном телэнцефалоне данио рерио. Такая экспериментальная установка может быть широко использована исследователями даже с минимальным предыдущим опытом для оценки ключевых факторов процессов, модулирующих поведение взрослых нервных стволовых клеток. Типичный эксперимент с анализом данных занимает до 1,5 месяцев.

Практическое применение

Эта технология может быть в дальнейшем применена для изучения молекул и путей, лежащих в основе поведения взрослых нервных стволовых клеток в интактном или поврежденном мозга in vivo, а также для тестирования соединений, которые потенциально могут модулировать такое поведение в живом организме. Технология является весьма перспективной для использования в экспериментальных исследованиях в области неврологии, регенеративной медицины, исследованиях процессов старения и т. д. Принципы, на которых построена эта технология, могут также быть транслированы для применения в моделях на животных других видов.

Лаборатории

• Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Center Munich, Neuherberg/Munich (Germany)
• Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, Coimbra (Portugal)
• Department of Biology, University of Naples Federico II, Naples (Italy)
• Biomedical Center, University of Munich, Munich (Germany)
• Excellence Cluster of Systems Neurology SYNERGY, Ludwig Maximilian University of Munich, Munich (Germany)

Ссылки

Публикации

• Barbosa, J.S. et al. «Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon." 11 Nature Protocols (2016): 1360–1370.
• Barbosa, J.S. et al. «Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain." 348 Science (2015): 789–793.
• Baumgart, E.v. et al. «Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis." 60 Glia (2012): 343–357.