Биомедицина

В проект моделирования тканей сердца вовлечены 50 ученых, работающие в девяти лабораториях, в том числе профессор Ратнер. Уже достигнуты определенные результаты, связанные с мышечными клетками. Например, участники проекта получили мышечные клетки, выстраивающиеся в правильные линии, которые отпечатались на поверхности, составляющей приблизительно одну пятую диаметра человеческого волоса, и начали биться синхронно — в параллельной ориентации. Другой подход — сделать пациенту биопсию после сердечного приступа, взять маленький кусочек сердечной ткани и, возможно, за 2 недели вырастить эту ткань, чтобы восстановить область, травмированную в результате сердечного приступа. Группа профессора Ратнера так же занимается разработкой новых методов получения подложек для применения в тканевой инженерии. Использование этого метода позволило произвести микропористые подложки фибрина, которые поддерживают рост клеток и имеют механические свойства, подобные многим натуральным тканям. Главная цель проекта — развитие части живого бьющегося мускула сердца. Разработан метод создания микропористой, нановолокнистой фибриновой подложки, которая имеет управляемый, заданный размер, пористость и микроструктуру для применения в тканевой инженерии.

Профессор Ратайчек возглавляет программу «Биология стволовых клеток». Его лаборатория пытается найти применение запрограммированым стволовым клеткам для регенерации тканей, в основном — в кардиоваскулярных заболеваниях. Вторая цель научной работы — понять природу и поведение при старении стволовых клеток определённых тканей. Лаборатории профессора Ратайчека удалось обнаружить новый тип стволовых клеток, который был впоследствии назван «очень маленькие стволовые клетки эмбрионального типа» (very small embryonic-like (VSEL) stem cells). Они имеют огромный потенциал в регенеративной медицине. Как оказалось, часть подобных стволовых клеток во время гаструляции и органогенеза откладывается в каждом органе. Эти клетки порождают уже органоспецифические стволовые клетки, которые стареют и постепенно элиминируются с возрастом. Однако, пул VSEL остаётся в органах почти неизменённым, образуя всё новые монопотентные (тканеспецифичные) стволовые клетки. Лаборатории удалось определить местоположение и специфические маркеры этих «стволовых клеток эмбрионального типа» в нескольких органах мыши. Один из основных маркеров VSEL — рецептор CXCR4, который по-видимому является определяющим в жизнедеятельности и функционировании этих клеток. В настоящее время ведутся работы по более детальному изучению VSEL клеток как в культуре клеток человека так и на мышах. Изучение этих клеток, локализация их в конкретных органах послужит важной предпосылкой для использования их в медицине в качестве регенеративного материала определённой ткани или органа.

Основные темы исследований лаборатории Томаса Рандо — старение стволовых клеток (сателлитных клеток) в мышце, влияние ниш стволовых клеток на этот процесс, возможность «омоложения» взрослых прогениторных клеток. Используя мышей в качестве моделей для исследования регенеративной способности мышечной ткани, исследователи группы Томаса Рандо выяснили, что с возрастом происходит уменьшение активации Notch (трансмембранные белки), результатом чего является ухудшение регенеративного потенциала сателлитных клеток. При повреждении «юных» мышц усиливается секреция трансмембранного лиганда Notch — Delta, инициируя, тем самым, Notch-сигнальный каскад в стволовых клетках, что приводит к их усиленной пролиферации. Воздействие сыворотки от моло-дой особи на сателлитные клетки старой особи in vitro также приводило к усиленной экспрессии Delta, большей активации Notch и выросшей пролиферацией этих клеток in vitro. Ещё одним важным результатом исследований стало доказательство того факта, что Wnt — сигнальная активность в активированных сателлитных клетках у старых мышей значительно выше, чем у молодых. Аналогично, при обработке сателлитных клеток «старой» сывороткой, активность Wnt возрастала. Поскольку Wnt играют существенную роль в фиброзе, то можно сделать вывод, что активация Wnt в этом случае означает, что сателлитные клетки старого организма активируются для образования фибрина, что ведет к дальнейшему фиброзу в регенерации мышцы. Таким образом, ингибирование Wnt- сигнального пути позволяет остановить дифференцировку стволовых клеток мышечного волокна в фиброзную ткань. Важные выводы, которые можно сделать из этих исследований:1. Соматические факторы могут моделировать молекулярные сигнальные пути, активирующие тканеспецифичные прогениторные клетки. 2. Микрооркужение (ниши) стволовых клеток у молодых животных стимулирует регенерацию, в то время как у взрослых особей либо не способно стимулировать, либо подавляет регенерацию тканей.3. Уменьшение регенеративной способности ткани с возрастом может быть обратимо при использовании определенных факторов. Ингибирование Notch у молодых мышей ухудшало регене-рацию их мышечного волокна, в то время как его направ-ленная активация возвращала в прежнее состояние реге-неративную способность волокон у более старой особи.

В лаборатории доктора Равкана на модели C. Elegans был идентифицирован целый ряд генов, положительно или отрицательно регулирующих пути и-РНК и micro-РНК. Выяснилось, что C. Elegans, подобно млекопитающим, для управления метаболизмом и долговечностью использует сигнальный путь инсулина. Лаборатория доктора Равкана рассмотрела 18 000 генов и их действие в регулировании долговечности, отложения жира, и-РНК и линьки C. Elegans. Стало ясно, что передача сигналов инсулина является самой мощной инактивацией гена, которая может увеличить продолжительность жизни C. Elegans. Текущее исследования в лаборатории Гэри Равкана направлены на объединение списков генов, регулирующих старение, в механизмы, которые оценивают и регулируют темп и вид метаболизма, регенерацию, защитные и дегенеративные механизмы. Эти списки генов иллюстрируют многие шаги в регулировании энергии, включая метаболические ферменты, которые хранят и мобилизуют жир, гормональные сигналы от жирных отложений до центров насыщения в мозге. У червя C. elegans жировой обмен регулируется 400 генами. 200 из этих генов имеют гомологи у человека. Поэтому в результате исследований, проводимых на C. Elegans, могут быть разработаны препараты для лечения людей от ожирения. Гены пути инсулина, которые были выявлены в результате исследова-ний, представляют новые цели для разработки в будущем препаратов от диабета. Эти исследования помогут понять нейроэндокринологию энергетического баланса и долгожительства.

Лаборатория Питера Рабиновича ведет исследования неопластических процессов, которые сосредоточены на предраковом состоянии при язвенном колите, с целью поиска биомаркеров развития опухоли. Неспецифический язвенный колит — это хроническое воспалительное заболевание толстого отдела кишеч-ника, ассоциированное с высоким риском развития колоректальной карциномы вследствие генетической нестабильности клеток. Ученые группы Питера Рабиновича предположили, чтобыстрое обновление клеток и окислительный стресс при язвенном колите могут приводить к ускоренному укорочению теломер и, в конечном счете, к хромосомным нарушениям и раку. Хромосомные аберрации и теломеры изучали у пациентов с язвенным колитом с дисплазией или без или в стадии рака с помощью гибридизации in situ. При биопсии теломеры пациентов с дисплазией были короче, чем у пациентов без дисплазии. Таким образом, результаты исследования показывают взаимосвязь длины теломер и хромосомной нестабильности в предраковом состоянии.

Исследования группы профессора Пэн сфокусированы на регуляции транспорта цитокинов (небольших пептидных информационных моле-кул) через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Этот физиологический «фильтр» регулирует обмен веществ между кровью и тканями мозга, оставаясь непроницаем для множества соединений, как чужеродных, так и вырабатываемых самим организмом. Ученые группы доктора Пэн исследуют механизмы внутриклеточного транспорта пептидов и белков через эндотелиальные клетки (один из основных компонентов гематоэнцефалического барьера) с периферии в центральную нервную систему. Еще одно направление исследований группы — регуляция пищевого поведения, связанного с взаимодействием лептина (гормона жировой ткани пептидной природы) и урокортина (пептида гомологичного кортикотропин-релизинг фактору) через ГЭБ. Предполагается, что урокортин — это мощный ингибитор пищевого поведения. Функции и механизмы действия лептина и урокортина пока до конца не исследованы, так как это сравнительно недавно открытые вещества. Группа доктора Пэн обнаружила суточные изменения транспорта лептина и фактора некроза ткани через ГЭБ, что может быть связано с регуляцией измененных состояний пищевого поведения. Преодоление ГЭБ для транспорта лекарственных средств, необходимых мозгу — одно из возможных направлений повышения эффективности медикаментозного лечения, в том числе и для ряда нейродегенеративные заболеваний мозга. Дальнейшие исследования функций лептина и урокортина могут быть важны для разработки лекарств от ожирения, вызывающего преждевременное старение организма человека.

Сферой интересов доктора Промислоу являются вопросы эволюционной демографии, эволюционного развития старения, биологии пола. Работы доктора Промислоу можно сгруппировать по следующим тематикам:1. Эволюционная генетика старения. Основное внимание уделяется степени и форме проявления генов «долгожительства» на фоне имеющегося у исследуемого вида общего пула генетического материала.2. Встречающиеся в природе вариации проявления феномена старения в пределах одного вида и изучение сопутствующих вариаций генотипа в популяциях с разной продолжительностью жизни,3. Изучение возрастных изменений физиологии и поведения как маркеров старения и приложение их как демографических маркеров старения,4. Половой отбор и его роль в эволюции старения. Полученные данные прямо свидетельствовали, что гены, модулирующие протекание старения, высококонсервативны не только по последовательности, но и функционально на протяжении миллиардов лет эволюции. Ценность полученных данных еще и в том, что их можно экстраполировать и на человеческий геном, тем самым подтверждая фундаментальную применимость данных, полученных на модельных организмах, к человеку. По его предположению поведение таких модулей может объяснять по-ведение реальных физиологических функций организма. Использование методов сравнительной генетики позволило количественно сравнить степень консервативности генов «долголетия» двух эволюционно далеко отстоящих друг от друга видов: дрожжей Saccharomyces cerevisiae и нематоды Caenorhabditis elegans. Особенное внимание доктор Промислоу уделяет построению генных сетей старения и выделению модулей (подсетей).

Лаборатория Томаса Проллы ведет исследования старения, направленные на выявление соединений, обладающих способностью имитировать действие ограничения калорийности питания. В ходе исследования самцы мышей B6C3F (1) получали либо диету с ограничением калорийности на 40% (контрольная диета, дополненная питательной смесью (NСМ), содержащей резвератрол, кверцетин и инозитолгексафосфат (ИГФ), либо диету с эквивалентной дозой химического резвератрола (RES; 1,25 мг резвератрола на кг в день) от 2-х до 5-месячного возраста. Профиль экспрессии генов сердца у мышей был сопоставлен с их ровесниками из контрольной группы. Результаты исследований позволили предположить, что RES и NСМ способны имитировать краткосрочное ограничение калорийности, которое однозначно повлияло на некоторые пути иммунной функции. При этом RES однозначно повлиял на различные пути стрессовой реакции. Путем анализа установлено, что NСМ регулируется несколькими метаболическими путями, которые также были изменены долгосрочным ограничением калорийности, в том числе обмен глюкозы и липидов, окислительное фосфорилирование и скопление хроматина. Рассмотрение ключевых генов и путей, зависимых от NСМ, позволяет предположить, что Foxo1 является важным восходящим посредником действия NСМ.

В лаборатории профессора Поспелова проводится исследование анти-пролиферативного действия ингибиторов HDAC. Они стимулируют ре-ацетилирование нуклеосомных гистонов и тем самым вызывают преобразование структуры хроматина в тех участках генов, в которых имела место HDAC-зависимая репрессия генов, в частности, контролирующих клеточный цикл. Проведенные эксперименты показали, что ингибиторы HDAC, не изменяя экспрессии р53, приводят к подавлению активности циклин-киназных комплексов. Кроме того, ингибиторы HDAC подавляют экспрессию ряда позитивных регуляторов клеточного цикла. В частности, бутират натрия вызывает накопление ключевого компонента Wnt-сигнального пути — бета-катерина, который вместе с кадгеринами участвует в адгезионной функции клетки, а вместе с факторами семейства Lef/Tcf осуществляет транскрипционную функцию. Исследования показали, что ингибиторы HDAC влияют на экспрессию важных компонентов, отвечающих за межклеточные взаимодействия (адгезию) и Wnt-сигнальный путь. Возможно, антипролиферативное действие ингибиторов HDAC может осуществляться через модуляцию активности кадгерин/бета-катенинового сигнального пути.

В лаборатории Мэтью Протеуса разработаны нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), способные создавать специфические двуцепочечные разрывы в ДНК клеток млекопитающих, которые в значительной степени стимулируют процесс гомологической рекомбинации. Особенность нуклеаз ZFN заключается в возможности модификации цинко-пальчатых доменов для связывания с различными последовательностями ДНК. В рамках разработки новой технологии были получены ZFNs для прицельной замены последовательности в гене GFP и гене CD8a человека. При сотрудничестве с Sangamo Biosciences (Richmond, CA), синтезирована нуклеаза, мишенью которой является экзон 5- рецептора интрелейкина общей γ-цепи. В гематопоэтических клетках такие нуклеазы вносят двуцепочечные разрывы с частотой 5–18%. Также в сотрудничестве с Sangamo сейчас разрабатывается нуклеаза, мишенью которой является локус β-глобина человека. Нуклеаза ZFN отличается от нуклеазы I-SceI своей цитотоксичностью при экспресиии в клетках млекопитающих. Она, возможно, обусловлена рестрикционной активностью вне сайта узнавания. Поэтому основные усилия направлены на преодоление цитотоксичности нуклеаз ZFN, что может быть достигнуто двумя путями — выявлением возможных сайтов — «немишеней» и их использования для вставки чужеродной ДНК, а также повышение специфичности и уровня экспрессии этих нуклеаз в клетке. Для повышения частоты направленной гомологической рекомбинации возможно применять аденосателлиты совместно с нуклеазами, которые могут повышать частоту рекомбинации в 100 раз. Теоретически возможно создание ZFN для направленной гомологиче-ской рекомбинации в любом локусе генома. Таким образом, применение аденосателлитных векторов поможет в будущем оптимизировать технологию направленной гомологической рекомбинации, которая может быть использована для лечения генных заболеваний.