Биомедицина

Доктор Тюссо выдвинул гипотезу о том, что в клетках, подвергнутых сублетальному воздействию стресса, должны вырабатываться биомаркеры клеточного старения. В своих ранних исследованиях в начале 90-х он обнаружил, что обработка фибробластов человека сублетальными дозами этанола и бутилгидропероксида вызывала появление типичных морфологических признаков клеточного старения. Сходные изменения происходили при обработке клеток перекисью водорода. Также было показано, что длительная и повторяющаяся обработка клеток провоспалительными цитокинами (IL-1α, TNFα, TGFβ1) также вызывала появление биомаркеров старения. Протеомный анализ позволил выявить несколько десятков белков, включая аннексин А2, IGFBP-3, кавеолин-1, гемоксигеназа-1, IL-1α и т. д., экспрессия которых была существенно выше в стареющих фибробластах. Группа доктора Тюссо также принимала участие в общеевропейском проекте GEHA (GEnetics of Healthy Aging), цель которого состояла в картировании генов, участвующих в регуляции продолжительности жизни, у европеоидов. В митохондриальной ДНК была найдена мутация С150Т, влияющая на эффективность окислительного фосфорилирования, и показано, что у пожилых людей происходит накопление митохондриального варианта 150Т, связанного со сниженной эффективностью работы дыхательной цепи митохондрий. Был найден локус на хромосоме 11, сцепленный с долголетием, который содержал целый ряд потенциальных генов-кандидатов «долголетия», включая гены сиртуина-3 (SIRT3), инсулина (INS), тирозингидроксилазы (TH), инсулиноподобного гормона роста-2 (IGF2) и протоонкогена HRAS1.

В группе исследователей под руководством профессора Пентии Туохимаа (Pentii Tuohimaa) проводятся работы по изучению влияния метаболизма витамина D на процессы старения и развитие связанных с возрастом заболеваний. Клинические данные показывают, что недостаток витамина D (3) связан с увеличенным риском некоторых заболеваний ЦНС, включая рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и Паркинсона, сезонные эмоциональные расстройства и шизофрению. В соответствии с этим, в последних исследованиях на животных и исследованиях с участием людей было выдвинуто предположение, что недостаток витамина D приводит к неправильному развитию и функционированию ЦНС.Ученые группы Пентии Туохимаа исследовали взаимосвязь старения и нарушения гормональной функции метаболизма витамина D (3) у мышей с удаленным геном рецептора этого витамина. Мышей содержали на специальной поддерживающей диете и анализировали их рост, состояние кожи и морфологию мозжечка, и общую двигательную активность. Также анализировалась экспрессия связанных со старением генов, таких как Fgf-23, ядерного фактора kappaB (NF-kappaB), p53, инсулин подобного фактора роста 1 (IGF1) и IGF1 рецептора (IGF1R) — в печени, klotho — в печени, почке и тканях простаты. Эксперименты выявили у мышей несколько связанных со старением фенотипов: более плохое выживание, раннее облысение, утолщение кожи, увеличение сальных желез, развитие эпидермальных кист, снижение с возрастом экспрессии всех генов, в том числе генов, связанных со старением. В целом, нарушения баланса в системе кальциферола, по-видимому, служат причиной нарушений функционирования ЦНС, включая преждевременное старение. Результаты исследований показали, что генетическое удаление гена рецептора витамина D(3) вызывает преждевременное старение мышей и что гомеостаз витамина D(3) регулирует физиологическое старение.

Несколько лет назад в лаборатории доктора Тревиса был клонирован один из генов цикла родопсина, кодирующий АТФ-связывающий кассетный переносчик (ABCR). Мутация в человеческом гене ABCR вызывает наследственную детскую слепоту, называемую болезнью Стадгардта. В настоящее время в лаборатории изучается молекулярная этиология болезни Стадгардта и разрабатывается рациональная фармакологическая терапия этого заболевания. Мыши с нокаутной мутацией в гене abca4 в больших количествах аккумулируют токсичные липофусциновые пигменты в эпителии сетчатки. Обработка этих мышей фенретинидом, ингибитором транспорта витамина, А в ткани глаза, блокировала образование этих токсичных пигментов. Ученые выдвигают гипотезу о том, что дополнительное получение витамина, А с пищей может ускорять образование липофусцина у мышей линии abca4(-/-). В эксперименте были использованы мыши дикого типа и мутантные мыши, которых содержали на нормальном и обогащённом витамином, А рационах. В результате было обнаружено, что у мышей дикого типа и линии abca4(-/-), получавших богатую витамином, А пищу, содержание липофусцина в эпителии сетчатки были значительно выше, чем в контрольных группах. Таким образом, витамин, А не должен применяться при лечении пациентов с мутациями ABCR4, или страдающих от других заболеваний, связанных с накоплением липофусцина в эпителии сетчатки.

Группа Тодда Траппе изучает изменения в структуре, функциях и биохимии коллагена в соединительной ткани мышц в процессе старения. Исследования на животных показали, что при старении и длительной неподвижности в соединительной ткани мышц увеличивается содержание коллагена, накапливаются гидроксилизилпиридинолиновые сшивки и продукты неэнзиматического гликозилирования. Исследования для человека впервые провела группа Тодда Траппе. После биопсии соединительной ткани мышц тренированных и нетренированных мужчин и женщин разного возраста удалось измерить концентрацию коллагена, коллагеновых сшивок и продуктов неэнзиматического гликозилирования. Среди людей, ведущих пассивный образ жизни (как мужчин, так и женщин) изменений концентрации коллагена и гидроксилизилпиридинолиновых сшивок с возрастом не наблюдалось. Однако отмечалось увеличение количества неэнзиматических сшивок при старении (на 200%). Также было показано, что в соединительной ткани мышц нетренированных людей вне зависимости от пола количество продуктов неэнзиматического гликозилирования увеличено, тогда как концентрации коллагена и гидроксилизилпиридинолиновых сшивок остаются неизменными. Изучение механизмов неэнзиматичекого гликозилирования в соединительных тканях мышц поможет понять причины старения и дисфункции скелетной мускулатуры.

Получившиеся после перепрограммирования клетки обладали нормальным кариотипом, в них была выявлена теломеразная активность, детектированы поверхностные антигены и маркеры, характерные для эмбриональных стволовых клеток. Было доказано, что получающиеся таким образом клетки, могут дифференцироваться во все три зародышевых слоя. Это было сделано на примере одного из самых распространенных наследственных неврологических заболеваний — спинально-мышечной атрофии. При этой болезни происходит избирательная потеря двигательных нейронов, ведущая к мышечной слабости и параличу. От пациента были взяты фибробласты, на основе которых получены iPS. Получившиеся клетки имеют тот же генотип, что и пациент, их можно длительное время поддерживать в культуре, и такие клетки могут быть дифференцированы в двигательные нейроны с признаками патологии. Таким образом, iPS могут стать прекрасной моделью для изучения наследственных и других заболеваний. В лаборатории Джеймса Томпсона было показано, что для перепрограммирования можно использовать несколько иной набор факторов, а именно Oct4, Sox2, Nanog и Lin 28. Было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть использованы для моделирования заболеваний человека. Также Томпсоном с соавторами была разработана новая система доставки факторов перепрограммирования в клетки с помощью oriP/EBNA1 эписомального вектора. Преимуществом такого способа является возможность бесследного удаления внесенных генов после перепрограммирования.

Тимус млекопитающих отвечает за пролиферацию, созревание и селекцию наивных Т-лимфоцитов. При старении происходит деградация тимуса и снижение его функциональной активности — инволюция. Снижение функциональной активности тимуса происходит, в основном, за счет уменьшения количества лимфоцитов. Процессы старения затрагивают дифференцировку Т-клеток в тимусе на различных стадиях. У стареющих мышей увеличивается число DN1 клеток. Переход от ста-дии DN1 к стадии DN2 обуславливает цитокин IL-7, количество которого уменьшается в процессе старения тимуса. Для дифференцировки DN1 клеток в DN2 клетки IL-7 увеличивает экспрессию анти-апоптозного белка bcl-2. Однако, из-за активации bcl-2 при сверхэкспрессии IL-7 возможны гиперпролиферация лимфоидных клеток и развитие лимфом. Для этого стромальные клетки трансфицируют in vitro в генетическую конструкцию, экспрессирующую IL-7. После этого трансфицированные клетки стромы вводят в тимус, где часть из них встраиваются в ткань. При этом исследователи показали, что при таком способе трасфекции ex vivo не только происходит восстановление тимопоэза, но и отсутствуют нежелательные проявления, связанные со сверхэкспрессией IL-7 в периферийных клетках иммунной системы. Чтобы обойти эти проблемы и увеличить тимопоэз при старении, ученые под руководством доктора Томана предложили вводить в тимус стареющих мышей клетки стромы, секретирующие IL-7.

DAF-16/forkhead — фактор транскрипции, который является молекулой-мишенью в инсулиноподобном сигналлинге. Он необходим для регулирования продолжительности жизни и стрессоустойчивости. Исследования, которые группа профессора Хейди Тиссенбаум проводила на объекте Caenorhabditis elegans, показали, что C-Jun N-terminal киназа (JNK) является положительным регулятором DAF-16 в обоих процессах. Также было показано, что JNK-1 непосредственно взаимодействует с DAF-16. Кроме того, в ответ на тепловой стресс, JNK-1 способствует транслокации DAF-16 в ядро. Таким образом, стал почти полностью понятен механизм, с помощью которого JNK-1 и DAF-16 регулируют долголетие и стрессоустойчивость.

Исследования группы доктора Андре Терцича открывают новые перспективы пренатальной терапии. Ученые вводили мышам меченые эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на ранней стадии эмбрионального развития. Новорожденные мыши не имели отклонений и имели тот же коэффициент риска развития сердечных заболеваний, что и животные контрольной группы. Характеристики работы сердца у животных обеих групп не различались на протяжении первого года жизни. У повзрослевших мышей с помощью перевязки левой передней артерии был сымитирован обширный инфаркт. У животных, которым во время внутриутробного развития вводили ЭСК, функции сердца через некоторое время после возобновления кровоснабжения миокарда полностью восстановились. А у животных контрольной группы развились типичные последствия ишемии миокарда: ишемическая кардиомиопатия, рубцевание сердечной мышцы и застойные явления в легких. Кроме того, мыши, еще до рождения получившие инъекцию стволовых клеток, после сердечного приступа быстрее восстанавливались, были способны переносить значительные физические нагрузки и стресс, имели лучшие показатели выживаемости.

В лаборатории Джона Тауэра показано, что снижение чувствительности организма к окислительному стрессу приводит к увеличению про-должительности жизни. Зависимость накопления свобод-ных радикалов от старения хорошо продемонстрирована и на модельных организмах. В лаборатории Джона Тауэра исследовали на чипах полногеномную экспрессию генов Drosophila melanogaster при окислительном стрессе и при старении. Оказалось, что в обоих случаях происходит повышение экспрессии белков теплового шока, генов иммунного ответа и антиоксидантных генов. Кроме того, в ряде лабораторий, в том числе и Тауэра, было показано, что, искусственно повысив экспрессию ряда генов, участвующих в антиоксидантном ответе, можно повысить продолжительность жизни организма. Введение старым животным специального вещества-ловушки свободных радикалов приводило к нормализации некоторых биохимических параметров до уровня состояния молодых животных.

Исследования Марка Татара направлены на понимание генетики, механизмов и эволюции старения. Особое внимание уделяется инсулиновому сигналингу. Каким образом физиологические и демографические функции могут ухудшаться с возрастом, в то время как естественный отбор неустанно увеличивает средний уровень здоровья? И как эволюция привела к фантастическим различиям продолжительности жизни, которые мы наблюдаем среди индивидуумов, видов и таксонов? Ответы на эти вопросы по мнению профессора Татара заключены в понимании того, как именно отбор воздействует на структурированные по возрасту популяции, и в понимании того, как экспрессия генов влияет на здоровье организма. Результаты экспериментов на C.elegans позволяют заключить, что сигналы, поступающие от гонад, регулируют продолжительность жизни и чувствительность к инсулину у этого вида, а также то, что регуляция процесса старения сигналами, поступающими от гонад -эволюционно консервативная черта.