Биомедицина

Под руководством Ива Криштена проводятся исследования нейропротекторных свойств растительных экстрактов при нейродегенеративных заболеваниях и травматических поражениях мозга, например, экстракта Гингко Билоба (Gingko biloba) EGb 761. Наряду с клиническими иссле-дованиями проводятся исследования на животных с искусственно создаваемыми моделями повреждения ЦНС, например, с моделью развития ишемического инсульта, или болезни Альцгеймера. В недавних исследованиях было выяснено влияние гемооксигеназы на нейропротекторные свойства экстракта EGb 761.У мышей дикого типа и мышей с выключенным геном гемооксигеназы 1 (HO-1) исследовалась модель ишеми-ческого инсульта, созданного при помощи окклюзии (закупорки) средней артерии большого мозга. Было показано, что мыши дикого типа, которым за 7 дней до инсульта вводился экстракт EGb761 имели на 50.9 ±5.6% меньше неврологических дисфункций и на 48.2 ±5.3% меньший объем инфаркта, чем мыши не потреблявшие экстракт. Однако этот эффект не наблюдался в HO-1 нокаутных мышах. Ученые предположили, что гемоксигеназа, которая синтезируется при повреждении мозга, участвует в обеспечении нейропротекторных свойств экстракта Гингко Билоба -EGb761. Экстракт Гингко Билоба обладает нейропротекторными свойствами при нейродегенеративных заболеваниях и ишемических инсультах и совершенно безопасен при приеме.

Ученые интегрируют экспериментальные данные с новейшими теоретическими концепциями с помощью компьютерных симуляций для предсказания функциональных изменений. Группа доктора Крита сосредоточена на трех проектах:1) построение модели клеточного старения с использованием экспериментальных и расчетных методов,2) моделирование физиологического уровня развития (физиома),3) создание новых расчетных структур для изучения пространственно-временных взаимоотношений на разных уровнях организации, от клетки до организма в целом. Поскольку данные, с помощью которых описываются биологические объекты, мультимодальные, необходима интегрированная модель. В основе предлагаемой концептуальной основы лежит рассмотрение элементов (мотивов) петель обратных связей. Способ обработки данных — использование нечеткой логики. С помощью таких моделей можно описывать, например, замкнутый круг митохондрия-активные формы кислорода или воспаление.

Область научных интересов лаборатории Рональда Кристала — разработка векторов на основе аденоассоциированных вирусов; генная терапия рака и заболеваний центральной нервной системы. Поздний младенческий неврональный цероид-липофусциноз (LINCL) вызывается мутацией в гене CLN2, приводящей к дефициту белка трипептидилпептидазы-I (TPP-I). В работах доктора Кристала было показано, что непосредственное введение в центральную нервную систему взрослых мышей, нокаутных по гену CLN2, вектора AAVrh.10hCLN2 (аденоассоциированного вируса серотипа rh.10, экспрессирующего кДНК CLN2 дикого типа), частично улучшает неврологические функции и повышает продолжительность жизни. Позднее ученые провели эксперименты с целью определения наиболее благоприятного возраста для генной терапии. Вектор вводили непосредственно в центральную нервную систему нокаутных по гену CLN2 мышей трёх возрастных групп (2-дневных, 3-х и 7-недельных). У всех опытных групп заметно увеличилась суммарная активность TPP-I по сравнению с мышами дикого типа. Однако через год после применения вектора гораздо более высокие уровни активности TPP-I в центральной нервной системе показали мыши, обработанные вектором непосредственно после рождения. Медиана смерти у неонатально обработанных мышей составила 376 дней, у обработанных в три недели — 277 дней, у обработанных в 7 недель — 168 дней, у мышей, не подвергавшихся лечению — 121 день. Полученные данные говорят о том, что максимальной эффективности генной терапии детских лизосомальных заболеваний, затрагивающих нервную систему, возможно достичь при раннем выявлении и лечении.

р53 — это хорошо изученный белок-онкосупрессор, который может запускать апоптоз как путем индукции транскрипции проапоптотических генов, так и напрямую влияя на митохондриальную мембрану. Примерно 50% случаев рака у человека связано с генетической или эпигенетической инактивацией p53. По-этому одной из задач исследования была попытка оценки взаимовлияния химиотерапии и сигнальных путей белка р53. Другой задачей было изучение участия р53 в развитии иммунодефицита человека. Недавно было обнаружено, что кроме канцерогенеза, р53, по всей видимости, играет ключевую роль в разрушении иммунной системы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). У носителей ВИЧ суперэкспрессированы некоторые гены-мишени р53 (например, PUMA — член проапоптотического семейства Bcl-2, а в экспериментах in vitro было показано, что p53 и PUMA лимитируют скорость индукции клеточной смерти от ВИЧ инфекции. Это было продемонстрировано на нескольких модельных системах, в том числе, при изучении вызванного геном Env апоптоза синцития и смерти клетки, индуцированной его продуктом — белком gp120. Исходя из этого, p53 можно рассматривать как новую мишень для терапии ВИЧ.

Пауль Коффер идентифицировал киназу белка B (PKB/c-akt) — новое звено во внутриклеточной передаче сигнала. Его исследовательская группа показала, что PKB-зависимое фосфорилирование факторов транскрипции FOXO является критическим для регулирования быстрого увеличения лейкоцитов и выживания. Эти исследования подтвердили роль эволюционно-консервативных транскрипционных путей в поддержании неограниченного срока службы кроветворных стволовых клеток. Совместно с профессором Бургерингом Пауль Коффер показал роль членов семейства факторов FOXO в иммунной системе. По результатам совместных исследований, активация только одного FKHR-L1 может объединить все известные элементы программы апоптоза, обычно вызываемой изъятием цитокина. Таким образом, PI3K/PKB-зависимое запрещение этого фактора транскрипции, вероятно, обеспечивает механизм предотвращения запрограммированной клеточной смерти. Пауль Коффер продолжает исследования регулирования внутриклеточных сигнальных путей и их роли в судьбе стволовой клетки. Результаты этой работы могут помочь в дальнейшей разработке способов лечения детской лейкемии и аутоиммунных болезней.

Особое внимание ученые обращали на изучение коллагеназ (MMP-1, -8 и -13), и других ферментов, которые разрушают фибриллярный коллаген. Также целью исследования была идентификация протеиназ, которые инициируют каскадный механизм активации матриксных металлопротеиназ. В ходе исследования на человеческой артритической ткани было обнаружено, что онкостатин М (OSM) + интерлейкин-1 (IL-1) совершенно точно стимулировали выделение коллагена из хряща — это ключевой момент в процессе разрушения хрящевой ткани. MMP-1, -3, -8 и -13 регулируются цитокином в сочетании с веществами семейства ADAM (дисинтегрин и металлопротеиназы). Была показана важность активации коллагеназ в процессе хрящевого коллагенового синтеза и его блокирование фурином и др. сериновыми протеиназами, ингибирующими подобную активацию. В планах ученых — исследовать роль связок гликопротеина-39, идентифицировать протеиназы, обнаруженные на поверхности клеток, открыть новые каскадные механизмы активизации MMPs, механизмы коллагенолиза, открыть новые субстраты для коллагеназ и эффект лекарств на метаболизм хряща. Таким образом, был открыт механизм коллагенового распада, понимание которого позволит разработать новые терапевтические меры предотвращения разрушения суставов при артрите.

Матриксные металлопротеиназы (ММП), а также их тканевые ингибиторы (TIMP) играют важную роль в процессах опухолевого роста, ангиогенеза, инвазии, метастазирования и в значительной степени определяют злокачественность опухоли. В лаборатории Татьяны Короленко для изучения фагоцитарной функции опухоль-ассоциированных макрофагов, а также уровня ММР/ TIMP -1 при опухолевом росте и метастазировании использовались мыши с трансплантированной аденокарциномой легких Льюис, метастазирующей в легкие. Для получения модели макрофагальной депрессии в печени, легких и опухоли мышам однократно вводили хлорид гадолиния (ХГД).В ходе исследования было показано, что поглощение ХГД клетками печени интактных мышей не влияло на концентрацию TIMP -1 в сыворотке крови и на активность ММП печени. Общая активность ММП была минимальна в опухолевой ткани и снижалась по мере роста опухоли. Формирование метастазов в легких сопровождалось снижением активности ММП в легочной ткани. Рост опухоли сопровождался увеличением концентрации сывороточного TIMP -1, но в меньшей степени по сравнению с мышами, получавшими ХГД. Развитие метастазов индуцировало снижение активности ММП в легких, ХГД не оказывал влияния на это процесс. Таким образом, важную роль в процессе опухолевого роста и метастазирования играет снижение функциональной активности ММP-2 вследствие увеличения экспрессии ее ингибитора TIMP-1.

Одним из симптомов болезни Альцгеймера является накопление полипептида A-бета42, продукта протеолиза белка-предшественника бета-амилоида. При этом у ученых не было точного понимания, какие именно гены и метаболические пути вовлечены в развитие обусловленной A-бета42 нейродегенерации. Для решения этой проблемы научные группы Консолаки и Шедла использовали дрозофилы как модель для изучения молекулярной симптоматики болезни Альцгеймера. В эксперименте экспрессируемый человеческий полипептид A-бета42 вызывал гибель клеток и общую деградацию ткани глаза мухи. При этом ученые обратили внимание на ген TolI (TI), который колирует рецептор регуляторного Tl-NFkB врожденного иммунного/воспалительного пути и является гомологом рецептора интерлейкина I (Ilk-1) млекопитающих. Оказалось, что мутации, ведущие к потере этим рецептором функциональной активности, существенно подавляют тканедегенеративный эффект A-бета42 и наоборот, мутации, усиливающие активность рецептора, способствуют ускорению развития болезни Альцгеймера. Более того, ученые выяснили, что и последующие компоненты Tl-NFkB цепи также непосредственно влияют на тканедегенеративную активность A-бета42. Генетическое манипулирование с элементами этой цепи позволяет непосредственно влиять на процесс клеточной гибели в глазе мухи. Известно, что у больных болезнью Альцгеймера в мозгу в значительной мере разбалансирован врожденный иммунитет по пути Ilk-1-NFkB. Возможно, коррекция Ilk-1-NFkB системы может иметь значимый терапевтический эффект при лече-нии болезни Альцгеймера и некоторых других возраст-зависимых заболеваний.

Обычно транстиретин присутствует в организме в форме тетрамера, но в некоторых случаях образуются мономеры белка, способные связываться между собой и образовывать фибриллы, что и становится причиной развития амилоидозов. Следовательно, для развития заболевания тетрамер белка сначала должен диссоциировать на мономеры. Ранее было показано, что способность транстиретина образовывать устойчивый комплекс может быть связана с химической модификацией отдельно взятого остатка цистеина (Cys10) в его составе путем образования смешанных дисульфидных связей. Наиболее распространенными модификациями белка в организме является присоединение к нему S-сульфоната и S-цистеина. Группа Лоурин Коннорс провела исследование влияния S-сульфоната и S-цистеина на устойчивость четвертичной структуры транстиретина. В результате было показано, что S-сульфонирование транстиретина усиливает процесс диссоциации тетрамера белка, что способствует развитию заболевания, в то время как присоединение S-цистеина, напротив, стабилизирует комплекс. Транстиретин в норме является устойчивым белком плазмы, но в случае старческого амилоидоза он откладывается в ткани в виде амилоидных фибрилл, что приводит к тяжелым дисфункциям органов. В дальнейшем понимание механизмов регуляции устойчивости стабильного тетрамера транстиретина может способствовать созданию новых методов лечения и профилактики амилоидозов.

Наиболее адекватным методом децеллюляризации (удаления донорских клеток) матрикса оказался детергентно-ферментативный. С его помощью были созданы экспериментальные модели in vitro и in vivoна животных по восстановлению тканей уретры, тонкого кишечника и трахеи. Полученные бесклеточные матриксы трахеи, обладая структурными и механическими характеристиками, подобными нативным трахеям, не проявляли антигенности и сохраняли способность к адгезивности для хондроцитов и эпителальных клеток. Эти свойства сохранялись при имплантации матриксов в качестве аллографтов либо ксенографтов. Другие способы удаления клеток с поверхности матриксов (обработка формалином, ацетоном и др.) не приводили к достаточному росту клеток и были отклонены. Участок трахеи длиной 7 см, выделенный из организма донора, после очистки от соединительной ткани и промывки в растворе антибиотиков подвергался обработке детергентом (Na-деоксихолат) и ферментом (ДНКаза). Это позволило практически полностью удалить донорские клетки (децеллюляризация) при сохранении хрящевого каркаса трахеи и исключить возможность отторжения имплантанта впоследствии.